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淀粉酶活性的測(cè)定
發(fā)布時(shí)間： 2023-01-30 點(diǎn)擊次數(shù)： 1581次原理
α-淀粉酶及β-淀粉酶，各有其一定的特性，如β-淀粉酶不耐熱，在高溫下易鈍化而α-淀粉酶不耐酸，在pH3.6以下則發(fā)生鈍化，通常提取液同時(shí)有兩種淀粉酶存在，測(cè)定時(shí)，可根據(jù)它們的特性分別加以處理，鈍化其中之一，即可測(cè)出另一酶的活性。將提取液加熱到70℃維持15分鐘以鈍化β-淀粉酶，便可測(cè)定α-淀粉酶的活性。或者將提取液用pH3.6之醋酸在0℃加以處理，鈍化α-淀粉酶的活性，以測(cè)出β-淀粉酶的活性。淀粉酶水解淀粉生成的麥芽糖，可用3，5-二硝基水楊酸試劑測(cè)定。由于麥芽糖能將后者還原生成3-氨基-5-硝基水楊酸的顯色基團(tuán)，在一定范圍內(nèi)其顏色的深淺與糖的深度成正比，故可求出麥芽糖的含量，以麥芽糖的毫克數(shù)表示淀粉酶活性的大小。材料與儀器
步驟
一、 實(shí)驗(yàn)材料儀器及試劑
1、實(shí)驗(yàn)材料：萌發(fā)的小麥（芽長(zhǎng)1厘米左右）
2、儀器：（1）小臺(tái)秤；（2）研缽；（3）容量瓶：100毫升×1；（4）具塞刻度試管25毫升×13；（5） 試管：8支；（6）刻度吸管：1毫升×2，2毫升×2；（7）離心機(jī)；（8） 恒溫水浴； （9）分光光度計(jì)。
3、試劑：
（1）1%淀粉溶液；
（2）0.4 N NaOH；
（3）pH5.6的檸檬酸緩沖液：A、稱(chēng)取檸檬酸20.01克，溶解后稀釋至1升；B、稱(chēng)取檸檬酸鈉29.41克，溶解后稀釋至1升。取A液13.7毫升與B液26.3毫升混勻，即為pH5.6之緩沖液。
（4）3,5-二硝基水楊酸：精確稱(chēng)取3,5-二硝基水楊酸1克溶于20毫升1N氫氧化鈉中，加入50毫升蒸餾水，再加入30克酒石酸鈉，待溶解后，用蒸餾水稀釋至100毫升，蓋緊瓶塞，勿使二氧化碳進(jìn)入。
（5）麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液：稱(chēng)取麥芽糖0.100克溶于少量蒸餾水中，仔細(xì)移入100毫升容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。
二、操作步驟：
1、酶液的提?。?br style="box-sizing: border-box; border: 0px solid; --tw-translate-x:0; --tw-translate-y:0; --tw-rotate:0; --tw-skew-x:0; --tw-skew-y:0; --tw-scale-x:1; --tw-scale-y:1; --tw-pan-x: ; --tw-pan-y: ; --tw-pinch-zoom: ; --tw-scroll-snap-strictness:proximity; --tw-ordinal: ; --tw-slashed-zero: ; --tw-numeric-figure: ; --tw-numeric-spacing: ; --tw-numeric-fraction: ; --tw-ring-inset: ; --tw-ring-offset-width:0px; --tw-ring-offset-color:#fff; --tw-ring-color:rgba(59,130,246,0.5); --tw-ring-offset-shadow:0 0 #0000; --tw-ring-shadow:0 0 #0000; --tw-shadow:0 0 #0000; --tw-shadow-colored:0 0 #0000; --tw-blur: ; --tw-brightness: ; --tw-contrast: ; --tw-grayscale: ; --tw-hue-rotate: ; --tw-invert: ; --tw-saturate: ; --tw-sepia: ; --tw-drop-shadow: ; --tw-backdrop-blur: ; --tw-backdrop-brightness: ; --tw-backdrop-contrast: ; --tw-backdrop-grayscale: ; --tw-backdrop-hue-rotate: ; --tw-backdrop-invert: ; --tw-backdrop-opacity: ; --tw-backdrop-saturate: ; --tw-backdrop-sepia: ; font-size: 1rem !important; line-height: 1.625rem !important;"/>
稱(chēng)取2克萌發(fā)的小麥種子（芽長(zhǎng)1厘米左右），至研缽中加一克石英砂，磨成勻漿倒入25毫升具塞刻度試管中，用蒸餾水稀釋至刻度，混勻后在室溫（20℃）下放置，每隔數(shù)分鐘震蕩一次，放置15-20分鐘，離心，取上清液備用。
2、α-淀粉酶活性的測(cè)定：
（1）取試管4支，注明兩支為測(cè)定管。
（2）于每管中各加酶提取液1毫升，在70℃恒溫水浴中（水溫度的變化不應(yīng)超過(guò)±0.5℃）準(zhǔn)確加熱15分鐘，在此期間β-淀粉酶受熱而鈍化，取出后迅速在自來(lái)水中冷卻。
（3）在試管中各加入1毫升pH5.6檸檬酸緩沖液。
（4）向?qū)φ展苤屑尤?毫升0.4N氫氧化鈉，以鈍化酶的活性。
（5）將測(cè)定管和對(duì)照管置40℃（±0.5℃）恒溫水浴中保溫15分鐘，再向各管分別加入40℃下預(yù)熱的淀粉溶液2毫升，搖勻，立即放入40℃水浴中準(zhǔn)確保溫5分鐘后取出，向各測(cè)定管迅速加入4毫升0.4N氫氧化鈉，以終止酶的活動(dòng)，然后準(zhǔn)備下步糖的測(cè)定。
3、α-淀粉酶及β-淀粉酶總活性的測(cè)定：
取上述酶液2-6毫升，放入容量瓶中，用蒸餾水稀釋至100毫升（稀釋程度視酶活性大小而定）混合均勻后，取4支試管，各加入稀釋之酶液1毫升及1毫升pH5.6之檸檬酸緩沖液。以下步驟重復(fù)α-淀粉酶的第（4）及（5）的操作，同樣準(zhǔn)備糖的測(cè)定。
4、麥芽糖的測(cè)定：
（1）取25毫升刻度試管7個(gè)，編號(hào)，分別加入麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)液（1毫克/毫升）0、0.2、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0毫升，置沸水浴中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，用分光光度計(jì)在520nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄消光值，以消光值為縱坐標(biāo)，以麥芽糖含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
（2）樣品的測(cè)定：取以上各管中酶作用后的溶液及對(duì)照管中的溶液各2毫升，分別放入25毫升具塞刻度試管中，再加入2毫升3,5-二硝基水楊酸試劑，混勻，置沸水中準(zhǔn)確煮沸5分鐘，取出冷卻，用蒸餾水稀釋至25毫升，混勻。用分光光度計(jì)在520nm波長(zhǎng)下進(jìn)行比色，記錄消光值，從麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線中查出麥芽糖含量，然后進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。注意事項(xiàng)
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