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哺乳動(dòng)物細(xì)胞抽提物中熒光素酶的測(cè)定實(shí)驗(yàn)
發(fā)布時(shí)間： 2021-12-16 點(diǎn)擊次數(shù)： 1722次原理
螢光素酶是理想的報(bào)告基因，因?yàn)椴溉閯?dòng)物細(xì)胞中不含內(nèi)源性螢光素酶，一旦轉(zhuǎn)錄完成立刻就生成功能性的螢光素酶，同時(shí)在所有的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)中，它的光產(chǎn)物具有最高的量子效率，檢測(cè)靈敏度高。熒光素酶報(bào)告基因被廣泛用于miRNA靶基因驗(yàn)證。
熒光素酶報(bào)告基因的原理在于miRNA主要通過作用于靶基因的3’UTR起作用，可以將目的基因3’UTR區(qū)域構(gòu)建至pGL3-basic載體中報(bào)告基因Luciferase的后面，構(gòu)建熒光素酶質(zhì)粒。然后轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，通過比較過表達(dá)或者干擾miRNA后，檢測(cè)報(bào)告基因表達(dá)的改變（監(jiān)測(cè)螢光素酶的活性變化）可以定量反映miRNA對(duì)目的基因的抑制作用。結(jié)合定點(diǎn)突變等方法進(jìn)一步確定miRNA與靶基因3’UTR的作用位點(diǎn)。
材料與儀器
DNA 轉(zhuǎn)染的哺乳動(dòng)物培養(yǎng)細(xì)胞
細(xì)胞裂解緩沖液 熒光素酶測(cè)定緩沖液 熒光素溶液 不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液
熒光光度計(jì)和光度計(jì)測(cè)置管 橡膠棒步驟
1. 轉(zhuǎn)染后 24-72 h, 室溫下用不含鈣鹽和鎂鹽的磷酸鹽緩沖液（PBS） 洗細(xì)胞 3 次。PBS 換液時(shí)要輕緩，因?yàn)橛行┎溉閯?dòng)物細(xì)胞（如人胎腎 293 細(xì)胞）在劇烈吹打時(shí)很容易從培養(yǎng)皿上脫落下來。通常，熒光素酶基因在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中獲得最大表達(dá)量的時(shí)間是 24-72 h。
2. 每個(gè) 100 mm 培養(yǎng)皿中的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入 lml 冰冷的裂解緩沖液。緩沖液輕輕旋轉(zhuǎn)， 然后用橡膠棒把裂解細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下來。細(xì)胞裂解物轉(zhuǎn)移到 1.5 ml 離心管中。
3. 細(xì)胞裂解物在 4°C 以最大速度離心 5 min。把上清小心地轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的 1.5 ml 離心管中。
4. 用 Bradford 測(cè)定等快速比色法確定裂解物的蛋白濃度。在測(cè)定蛋白濃度前，為了防止干擾，把 TritonX-100 的濃度稀釋到小于等于 0.1%。這步中，細(xì)胞裂解液可以分成小份， 貯存在-70°C。雖然貯存在或-20°C 時(shí)，熒光素酶在裂解緩沖液中不穩(wěn)定（Brasier et al.1989）， 但是在含 15%（V/V）甘油和 1%（m/V） 牛血淸白蛋白的緩沖液中，該酶可以在 4°C 安全貯存。
5. 敲打盛有裂解物的管子的管壁，輕輕使裂解物混合。室溫下，在每個(gè)含有 360ul 熒光素酶測(cè)定緩沖液的熒光光度計(jì)管中加入 5-200ul 細(xì)胞裂解液。管子放入熒光光度計(jì)。
除了可使用熒光光度計(jì)測(cè)量熒光素酶活性，還有另一種方法在欄目替代方案：用閃爍計(jì)數(shù)器測(cè)量熒光素酶活性。
6. 測(cè)定開始，200ul 熒光素溶液加到熒光光度計(jì)管中，然后在室溫測(cè)量 2-60s 時(shí)間內(nèi)的光輸出。測(cè)光輸出時(shí)間的最佳長(zhǎng)短要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)確定，而且與轉(zhuǎn)染細(xì)胞的類型以及所用的特殊底物和熒光素酶有關(guān)。
7. 測(cè)定每個(gè)管子產(chǎn)生的相對(duì)光單位數(shù)，并確定測(cè)量的線性范圍。使用適當(dāng)量的細(xì)胞裂解蛋白，使它在隨后測(cè)量中產(chǎn)生的值位于線性范圍的中部。根據(jù)所研究啟動(dòng)子的強(qiáng)度以及每次實(shí)驗(yàn)的轉(zhuǎn)染效率，所需蛋白的量會(huì)有變化。細(xì)胞裂解物中熒光素酶活性可以用相對(duì)光單位數(shù)或毫克表示。
注意事項(xiàng)
熒光素是能夠受熒光素酶催化發(fā)光的底物的通稱。常用的熒光素酶基因來自螢火蟲，它作用于特定的熒光素底物。其他如來自海三色堇或某種海洋細(xì)菌的熒光素酶所使用的熒光素底物具有不同的化學(xué)性質(zhì)。確定前面緩沖液中所用的熒光素底物確實(shí)與表達(dá)質(zhì)粒中的熒光素酶基因相匹配。
常見問題
為了減少內(nèi)在的變化因素，比如：培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)目、細(xì)胞轉(zhuǎn)染和裂解的效率等對(duì)實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性的影響，將帶有熒光素酶基因的質(zhì)粒作為對(duì)照質(zhì)粒與報(bào)告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，提供轉(zhuǎn)錄效率的內(nèi)對(duì)照，使測(cè)試結(jié)果不受實(shí)驗(yàn)條件變化的干擾。在測(cè)量過程中，首先加入熒光素酶檢測(cè)試劑時(shí)產(chǎn)生螢火蟲熒光信號(hào)，這樣先測(cè)量螢火蟲熒光素酶活性。定量螢火蟲熒光強(qiáng)度之后，再在同一樣品中加入Stop&Glo Reagent試劑，將上述反應(yīng)淬滅，并同時(shí)啟動(dòng)海腎熒光素酶反應(yīng)，進(jìn)行第二次測(cè)量，稱之為雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。
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