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免疫組化之8大疑難解答
發(fā)布時間： 2021-09-08 點擊次數(shù)： 1858次IHC 常見的 8 大疑問
Q1：冰凍切片和石蠟切片如何取材？
Answer: 冰凍切片取材可分為兩種情況：1）動物灌流固定：如小鼠心臟灌流，首先采用預(yù)冷的 1×PBS 灌流沖洗直至血液全部放出，隨后灌注 4%PFA 直至小鼠僵直，而后解剖獲取組織，于 4℃、4%PFA 中固定 1h 左右，1×PBS 洗 5 次（30min/次），25%蔗糖溶液脫水 12h 左右包埋即可。 2）直接取材：直接選擇新鮮組織進行冰凍切片，此時不需要進行抗原修復(fù)。缺點：切出的片子含水量會比較多，形成冰晶影響結(jié)果，而且后期的丙酮固定也會改變細(xì)胞的形態(tài)。石蠟切片：動物組織取材（灌流與否都可以，并不影響后續(xù)的操作）后，置于 10%福爾馬林溶液中固定 3-4 天后，脫水，包埋，即可進行石蠟切片操作。
Q2:石蠟切片和冰凍切片的區(qū)別比較
Answer: 1）石蠟切片制備過程較復(fù)雜，抗原活性差，但切片?。?-5μm），便于觀察細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)，且常溫保存即可，非常方便。2）冰凍切片較厚（8-12μm），操作簡單，抗原活性好， 但是保存時間短，且一定放在-80℃的低溫冰箱中。
Q3：一抗的選擇要點是什么？
Answer：1）一般單克隆抗體特異性強，但親和力相對小，檢測抗原靈敏度相對低；而多克隆抗體特異性弱，但抗體的親和力強，靈敏度高，但易出現(xiàn)非特異性染色（可通過封閉來避免）。2）抗體的比例可依據(jù)抗體說明書或 western blot 的抗體比例來做即可。3）對于組織樣本，一般要在 37℃孵育 1-2h 或 4℃冰箱孵育過夜（效果較為佳，且拿出后需 37℃復(fù)溫 45min），并保持濕盒里的濕度來防止抗體蒸發(fā)。對于難以著色的，在第二天還需將濕盒置于室溫孵育。
Q4：如何選擇封閉血清？
Answer：封閉血清一般是和二抗同一來源，可封閉非特異性結(jié)合位點，降低背景噪音。也可使用小牛血清、BSA、羊血清等，但不能與一抗的來源一致。
Q5：DAB 顯色時間如何把握？
Answer：可選擇一張陽性的片子，用計時器精確計時在顯微鏡下判斷出具體時間后，再對所有片子進行顯色，采用相同的時間來界定。一般如果抗體濃度適宜，操作無誤，10 分鐘內(nèi)肯定能夠顯色，如果超過該時間，說明一抗比例不夠或者封閉太久等等原因。顯色時間越短，則說明抗體濃度高或抗體孵育時間過長，需下調(diào)抗體濃度或縮短抗體孵育時間。
Q6：IHC 復(fù)染時間的選擇？
Answer：蘇木素復(fù)染時間一般為 5min 左右，可調(diào)整，染色時間太淺，可延長時間，反之縮短時間；隨后進行鹽酸酒精分化，數(shù)秒即可，自來水洗，最后置于氨水中返藍(lán)。
Q7：免疫組化的結(jié)果如何分析？
Answer：1）必設(shè)對照組。如陰性、陽性及自身對照。
由表中可知，只有 6、7 實驗結(jié)果有意義。1-5 均因?qū)φ战M的結(jié)果已否定抗體的特異性或因 ICH 技術(shù)操作存在錯誤等而使實驗結(jié)果失去意義，則必須重復(fù)實驗或換用抗體。 2）陽性著色細(xì)胞計數(shù)法。在 40 倍光鏡下，隨機選擇不重疊的 10 個視野，人工或機器計數(shù)陽性著色細(xì)胞，每組 3-6 張不同動物組織切片，然后進行組間比較即可。 3）灰密度分析法。通過在不同組別和不同動物組織切片上選擇相同區(qū)域、相同條件下用 image j 進行灰密度分析，然后進行統(tǒng)計分析即可。 4）分級法。免疫組化的半定量一般分為三級：弱（+），中（++），強（+++）。以綠色免疫熒光為例，則表現(xiàn)為淺綠色熒光、明顯綠色熒光和亮綠色耀眼熒光。弱（+）=1，中（++）=2，強（+++）=3。至少隨機觀察 5-10 個 HPF。然后根據(jù)（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3 計算出數(shù)值；總數(shù)值<1.0 者為（+），1.0-1.5 者為(++), >1.5 者為(+++)。
Q8：IHC 常見的疑難雜癥有哪些？
Answer：
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血清系列
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細(xì)胞轉(zhuǎn)染
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支原體清除
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細(xì)胞凍存
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實驗耗材
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分子試劑
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細(xì)胞增殖與凋亡
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Biozellen系列
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培養(yǎng)基
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ELISA試劑盒
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TOYOBO（東洋紡）
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ZYMO RESEARCH
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Greiner（格瑞納）
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IKA（艾卡）
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化學(xué)發(fā)光底物（ECL）
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PROSPEC系列
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Epigentek系列
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微生物檢測
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細(xì)胞生物學(xué)
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Corning康寧
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解離試劑
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細(xì)胞類-實驗耗材
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原代細(xì)胞
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植物檢測系列試劑盒
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SERANA
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細(xì)胞系
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生化試劑盒
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環(huán)境檢測系列試劑盒（AKEN）
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類器官培養(yǎng)
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緩沖器和解決方案
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生物三凝膠基質(zhì)
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細(xì)胞因子分子
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生物樣本庫
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蛋白研究系列
